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干貨分享丨代謝組學(xué)問題集錦之進(jìn)階篇

經(jīng)過上一期的基礎(chǔ)篇學(xué)習(xí),想必大家對(duì)代謝組學(xué)這個(gè)神秘的學(xué)科有了更系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)。那么如何選擇適合項(xiàng)目的檢測(cè)方法?用什么平臺(tái)做檢測(cè)?大家是不是還很懵,別著急,這期小編就把答案告訴大家。話不多說帶著問題一起來讀!


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代謝組學(xué)檢測(cè)方法是按什么進(jìn)行分類的?

主要是根據(jù)研究目的分為靶向、非靶兩大類,近年來還有擬靶向、代謝流等分類。


靶向:針對(duì)某一類特定的代謝物進(jìn)行檢測(cè)分析,是一種有偏向性的檢測(cè)手段。主要適合驗(yàn)證型研究,獲得目標(biāo)代謝物在不同組別樣本及不同批次樣本中的絕對(duì)含量。定性依賴標(biāo)準(zhǔn)品,定量依靠標(biāo)準(zhǔn)曲線。


非靶:是對(duì)生物體內(nèi)源性代謝物進(jìn)行系統(tǒng)全面的分析,獲取盡可能多的代謝物數(shù)據(jù),找出組間差異代謝物,是一種無偏向的代謝組學(xué)分析。主要適合發(fā)現(xiàn)型研究,定性主要依靠數(shù)據(jù)庫,結(jié)果相對(duì)定量。


擬靶向:結(jié)合靶向和非靶的優(yōu)點(diǎn),在方法建立時(shí),用高分辨質(zhì)譜獲取代謝物的離子對(duì)信息,而在實(shí)際樣品分析時(shí)采用靶向的多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)方式測(cè)量代謝物的濃度。


代謝流:是利用穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù),檢測(cè)下游代謝產(chǎn)物的同位素取代形式(M+0/ M+1/ M+2/ …),從而分析出該化合物在代謝通路中的流向和分布。通過對(duì)生物體進(jìn)行代謝流分析,可得到生物體特定代謝通路的活躍程度。

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怎么選擇檢測(cè)平臺(tái)?

不同平臺(tái)有各自的優(yōu)勢(shì),比如NMR的重現(xiàn)性好樣品無損,LC所需樣品較少靈敏度高,GC適合可揮發(fā)性的代謝物。


根據(jù)關(guān)注的代謝物和實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩磉x擇,比如想測(cè)脂蛋白亞類,就只有NMR平臺(tái)可以滿足要求;想測(cè)脂肪酸,主要就靠GC-MS;想測(cè)低濃度的神經(jīng)遞質(zhì),要用UPLC-QQQ-MS。如果想測(cè)非靶,主要用NMR和QTOF-MS來完成。

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代謝組學(xué)檢測(cè)怎么設(shè)置質(zhì)控?

質(zhì)控樣:一般選擇將該批次所有檢測(cè)樣本混合,檢測(cè)過程與正式樣本相同,在該批次前后走若干針,檢測(cè)樣品中固定間隔走一針。監(jiān)控整個(gè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性,易發(fā)現(xiàn)因系統(tǒng)污染、儀器故障(如靈敏度下降、保留時(shí)間變化、質(zhì)量準(zhǔn)確度變化)引起的問題。


平行樣:選擇不少于樣品總數(shù)5%的樣本分成平行3份,貫穿整個(gè)樣品制備、檢測(cè)和分析過程。監(jiān)控實(shí)驗(yàn)全過程的穩(wěn)定性。

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定量限、檢測(cè)限是什么意思?

定量限(LOQ)是指在某一指定水平的準(zhǔn)確度和精密度下能夠可靠定量的最低濃度。


檢測(cè)限(LOD)是指能被可靠檢測(cè)的最小濃度。LOD與體系的信號(hào)和噪聲有關(guān),通常被定義為信噪比大于3倍。

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什么是MRM?

MRM:多反應(yīng)監(jiān)測(cè),multiple reaction monitoring。MRM基于目標(biāo)分子的信息,有針對(duì)性的選擇數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集,對(duì)于符合目標(biāo)離子規(guī)則的信號(hào)(母離子-子離子對(duì))進(jìn)行采集,去除不符合規(guī)則的離子信號(hào)的干擾。允許符合設(shè)定的母離子進(jìn)入碰撞室,碰撞完成后,只記錄設(shè)定子離子信號(hào)。

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什么是基質(zhì)效應(yīng)?

是指基質(zhì)對(duì)分析方法準(zhǔn)確測(cè)定分析物的能力的干擾。普遍認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)的產(chǎn)生是質(zhì)譜離子源中樣品離子化過程中,由內(nèi)源性或外源性基質(zhì)物質(zhì)與目標(biāo)化合物競(jìng)爭(zhēng)電荷和中和離子化過程引起的。生物樣本中的很多物質(zhì)都可能產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng),內(nèi)源性的通常是存在于生物樣本中的一些有機(jī)物(蛋白質(zhì),脂肪,磷脂等)和無機(jī)物,可能還包括體內(nèi)形成的一此代謝產(chǎn)物。外源性的來自于樣品制備過程或者樣本處理中引入的外來物質(zhì),比如抗凝劑。

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如何避免和消除基質(zhì)效應(yīng)?

在樣品的前處理階段,可以選擇性的去除干擾物,比如蛋白沉淀;選擇合適的內(nèi)標(biāo),抵消和降低不利影響;調(diào)整合適的液相分離條件;稀釋樣品;選擇合適的API離子源和離子極性。

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是不是有標(biāo)準(zhǔn)品就可以定量檢測(cè)?

不是,標(biāo)準(zhǔn)品的具備是定性和絕對(duì)定量的必需條件,但是要從生物樣本中檢測(cè)到目標(biāo)代謝物,需要建立合適的方法(樣品制備、色譜分離、質(zhì)譜檢測(cè)等),這個(gè)過程需要有豐富方法開發(fā)的工作者投入大量時(shí)間來完成,即便如此,方法開發(fā)也依舊有失敗的風(fēng)險(xiǎn),比如目標(biāo)物極不穩(wěn)定。

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為什么有些代謝物的檢測(cè)需要衍生化?

主要是為了改善目標(biāo)物的響應(yīng)、極性、穩(wěn)定性和分離性能。比如將紫外吸收官能團(tuán)引入可提高靈敏度、將熱不穩(wěn)定的代謝物衍生后提高穩(wěn)定性等。

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質(zhì)譜中 TOF、QQQ、QTRAP、Orbitrap 都代表什么?

這些都是質(zhì)譜中常見的質(zhì)量分析器。

TOF(times of flight 飛行時(shí)間):不同的離子可通過電場(chǎng)加速至同樣的動(dòng)能,而其速度由質(zhì)荷比決定。因此可用飛行時(shí)間技術(shù)測(cè)量速度從而得知質(zhì)荷比。特點(diǎn)是分辨率高、靈敏度低,適合非靶研究。


QQQ(triple quadrupole 三重四級(jí)桿):由三個(gè)依次串聯(lián)的四極桿組成,其中第一個(gè)四極桿(Q1)和第三個(gè)四極桿(Q3)用作質(zhì)量過濾器,第二個(gè)四極桿(Q2)用作離子碰撞室。特點(diǎn)是靈敏度高、分辨率低,適合靶向定量研究。


QTRAP: 四級(jí)離子阱,是以QQQ為基礎(chǔ),第三個(gè)四級(jí)桿(Q3)即可以做三重四級(jí)桿也可以做線性離子阱,具有三重四級(jí)桿的掃描功能,兼具線性離子阱的高靈敏度定性掃描和多級(jí)掃描功能,以及三重四級(jí)桿和線性離子阱結(jié)合在一起的掃描功能。


Orbitrap: 軌道離子阱,為Thermo公司獨(dú)有技術(shù),被用于高分辨的質(zhì)譜分析平臺(tái)。


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