英國代謝表型協(xié)會推薦：如何評估靶向代謝組學質量
基于LC-MS的靶向代謝組分析被廣泛用于小分子代謝物的檢測。然而，目前業(yè)界還沒有被廣泛接受的標準來確保目標代謝物檢測方法的可靠性。近日，來自英國代謝表型協(xié)會的研究人員于2023年5月在Nature protocols雜志上發(fā)表觀點性文章，總結了歐洲藥品管理局、美國食品和藥品管理局和國際技術協(xié)會協(xié)調理事會提供的相關指導。在此基礎上進行綜合和調整，提出一個相對簡單的，可用于評估代謝組分析可靠性的“分級方法”，包括發(fā)現(xiàn)、篩選、鑒定和驗證四個方面�？紤]了代謝組分析中所遇到的各種問題以及可能的解決方法。原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41596-022-00801-8。
代謝組學是研究代謝組的一門科學，而廣義的代謝組包括宿主內源性代謝物、外源性小分子物質以及微生物來源的代謝物。代謝組學在系統(tǒng)生物學研究中起了重要作用，其揭示了從基因到代謝活動的變化，以及基因與環(huán)境之間相關作用的代謝網(wǎng)絡。此外，代謝組學還可以用于生物標志物的發(fā)現(xiàn)。
代謝組學分析方法通�？梢苑譃榘邢蚍治�、非靶向分析以及二者相結合。非靶向代謝組學是一種以發(fā)現(xiàn)為基礎的方法，其目的是盡可能多的無偏倚地檢測代謝物，然后再將與表型相關的代謝物（或者叫生物標志物）進行鑒定。靶向代謝組分析則側重于分析已知代謝物，其所用方法通常是定量一類代謝物。靶向代謝組學是以假設為基礎，由于測量已知代謝物，通常具有較高的靈敏度和選擇性，不足之處是代謝物覆蓋范圍有限。非靶向代謝組學主要用于產(chǎn)生假設，具有較大的代謝物覆蓋范圍和生物標志物發(fā)現(xiàn)潛力，其不足之處是所檢測代謝物為相對定量，而不是絕對濃度。
用于代謝組分析的主要技術包括LC-MS、GC-MS和NMR，其中LC-MS使用最為廣泛。靶向方法的難點之一在于獲得合適的內標。另一方面，靶向檢測的優(yōu)點是目標代謝物是已知的，因此對其預期水平、轉化速率以及個體內和個體間的差異比較了解，有利于分析人員開發(fā)合適的檢測方法來產(chǎn)生可靠的數(shù)據(jù)。然而，由于對新發(fā)現(xiàn)的生物標志物知之甚少，方法開發(fā)要重點關注并行性、選擇性和靈敏度，在稍后檢測階段可以對方法進行微調以滿足檢測要求。
代謝組學已經(jīng)被用于發(fā)現(xiàn)新的臨床和毒理診斷標志物。然而，代謝組學研究進行臨床轉化還存在一些挑戰(zhàn)，存在的主要問題包括分析的可重復性、準確性、精密度、代謝物的定性和定量、研究設計、樣品處理，缺少發(fā)表數(shù)據(jù)的標準化報告，數(shù)據(jù)的開放獲取不夠，在Biobank中的整合不足，不同批次之間存在變異，不同方法存在偏倚。鑒于上述代謝組學分析的特點，要評估代謝組學分析方法的可靠性并不容易。因此有必要定義評估方法可靠度的程度，評估的范圍，以及如何選擇合適的標準和報告方法。
在本文中，作者提出了評估基于質譜的靶向代謝組分析可靠性的指南�，F(xiàn)有的生物分析方法驗證指南，包括四級框架，生物分析檢查清單如Box1所述。
建議的用于評估代謝組學分析方法可靠性的分級框架指南
考慮到代謝組學應用廣泛，LC-MS技術不斷發(fā)展，很顯然有必要提出一個描述可靠性的統(tǒng)一框架，能勝任于不同的應用。對是否符合目的的評估涉及到以下問題：（i）該分析的使用背景，即數(shù)據(jù)是用來做什么的；（ii）是定量、半定量還是相對定量分析；（iii）評估對不確定性的容忍度。建議的框架指南總結在Table 1，第1和第2級（Tiers 1 and 2）針對靶向代謝組學為本文的重點，所有用于評估的參數(shù)總結在Table 2。
第1級：經(jīng)過驗證的方法
第1級驗證涉及通過使用傳統(tǒng)的靶向代謝物分析進行疾病和毒性表型的診斷，通常可以對一到十幾種代謝物進行絕對定量。第1級驗證是符合法規(guī)的臨床診斷機構所必需的，這一過程需要每種代謝物都有相應的標準物（外標）。
第2級：合格的方法
第2級定量涉及使用靶向代謝組分析對多余10種代謝物進行絕對定量，用于疾病和毒理表型的診斷。同樣需要準備每種代謝物的外標，其方法檢驗的標準不如第1級驗證嚴格。
第3級：篩選方法
第3級篩選涉及疾病和毒性表型的篩查，主要通過使用多重靶向或混合代謝組學分析對數(shù)百個代謝物進行相對或者半定量檢測。這并不需要每個代謝物都有相應的外標，用于篩選方法的標準不像第2級驗證那么嚴格。
第4級：發(fā)現(xiàn)方法
第4級發(fā)現(xiàn)包括通過使用非靶向或混合代謝組學在實驗中進行相對定量以發(fā)現(xiàn)假定的代謝生物標志物。非靶向方法的標準最不嚴格�？墒褂眠m合系統(tǒng)的QC樣品，研究內QC樣品，實驗室間QC樣品，對混合QC樣品進行系列稀釋等。
靶向代謝組學分析和多代謝物檢測
靶向代謝組學研究通常需要對多種分析物進行定量（包括絕對定量，半定量或者相對定量）來進一步探索非靶方法鑒定的潛在生物標志物和驗證由此產(chǎn)生的科學假設。靶向與非靶向代謝組學之間的差別很小，通常有重疊。
LC-MS多靶分析允許在同一次分析時檢測多種分析物。雖然隨著分析物數(shù)量的增多，良好的準確性和精密度很難保證，但多靶分析仍比單靶分析提供更多的關于生物標志物的信息。如規(guī)章標準所述，在同一次分析中所有的定量分析物需滿足同樣的接受標準。如果一個分析物未能達到，則這個分析就是失敗的。然而，多靶代謝組分析中，如果大多數(shù)分析物符合檢測標準，沒有必要對所有代謝進行重新分析。
此外，可視檢測代謝物的數(shù)量和分析的目的降低驗收標準 （Table 1）。一種考慮是可以將LLQQ的變異從20%增加到30-40%。有一點需要謹記，增加LLQQ重復樣品數(shù)量會使變異（RSD）變低，并且分析變異度的可容忍度取決于樣品的生物變異。分子量大的生物分子通常比小分子代謝物的變異要大，因此FDA推薦的大分子重復分析的變異要小于30%，而小分子則需要小于20%。在本文建議的框架下，第2級的驗收標準更為寬松，因為重復樣品的數(shù)量較少。然而，如果當檢測代謝物數(shù)量較多時，推薦增加第2級檢驗的校正點。另外，生物標志物應同時評估其絕對定量和半/相對定量方法。
有關靶向、非靶向和混合代謝組分析產(chǎn)生高質量數(shù)據(jù)的生物分析方面的考慮
在生物分析不同階段，良好的實驗室規(guī)范的重要性都要給予重視。樣品、分析物和數(shù)據(jù)的完整性以及基本的實驗記錄保存都是必不可少的。非常推薦大家使用實驗室信息管理系統(tǒng)。實驗儀器的日常校正、移液器和天平有書寫清楚并且標準的操作程序、合適空白樣品的選擇、內標、適合分析系統(tǒng)的測試和不同研究間的QC樣品都是必需的。批次間的QC樣品應放置在正式分析中，分析樣品檢測順序被QC樣品分開，以確保整個分析的精度。推薦使用表型（比如健康 vs疾病）QC樣品。QC樣品通常是將少量的所有檢測樣品混合制成的，被用于整個分析過程中。對于非靶向分析，強烈建議使用系列稀釋的QC樣品以幫助區(qū)分來自LC-MS化學背景的生物特征。同位素標記標準品的使用可以對不同研究的精度提供一個廣義的測量。此外，使用同位素標記的內標可以幫助消除基質導致的離子化效率的影響，因此可以提高分析的準確性。推薦使用合適的替代基質來提高生物標志物定量的靈敏度和選擇性。條件允許的情況下，應該使用含有最低含量內源分析物的空白樣品。此方法適合多靶分析，但是每一個分析物的基質效應和穩(wěn)定性應該予以研究。如果沒有空白樣品，標準加入法可以用來分析檢查回收和基質效應。使用QC或者準備的標準品來檢測方法的準確性和可重復性是一種假設最少的方法。人工準備的空白基質也可以使用，4% 脫脂牛血清白蛋白溶液（溶解在生理鹽水中）可以用作人血漿的空白基質。用于校正樣品量不同導致差異的方法也應予以考慮。比如，尿液肌酐常用于校正尿液生物標志物的濃度。
所有的靶向分析都應該對檢測限和定量限有明確的定義。必需有信號高于基線噪音清晰可辨的譜峰，譜峰要包含特定的數(shù)據(jù)點（通常大于等于6個數(shù)據(jù)點）。作為一般規(guī)則，定量限的信噪比（S/N）應該≥5，檢測限S/N約為3。這一方法與國際機構的要求是一致的。對于靶向分析，所有峰的信噪比都要進一步確認以保證其達到了要求。然而，對于大規(guī)模的代謝組分析，對每個峰進行手動檢測并不現(xiàn)實。但是，如果某些代謝物或者特征被判定為離群點，那么這些譜峰需要先進行人工檢查來確認差異是真實的還是數(shù)據(jù)質量問題。
