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新文速遞丨Biophys Rep 50種脂肪酸的快速定量方法
脂肪酸(FAs)是所有具有多種生理功能的生物體的重要營(yíng)養(yǎng)素,定量分析大量人群隊(duì)列中少量生物樣品的脂肪酸組成(脂肪酸組)對(duì)于理解這些功能至關(guān)重要。脂肪酸通?煞譃轱柡椭舅岷筒伙柡椭舅幔▎尾伙柡椭舅岷投嗖伙柡椭舅。多不飽和脂肪酸(包括n3和n6)是哺乳動(dòng)物以及人類的必需脂肪酸,在生物樣品中,這些脂肪酸以游離脂肪酸(FFAs)和酯化脂肪酸的形式存在,例如磷脂、鞘脂(SPs)、甘油酯、膽固醇酯(CEs)、羥基脂肪酸的脂肪酸酯(FAHFAs)和;鈮A。FAs及其代謝物的生物學(xué)功能多種多樣,包括細(xì)胞膜穩(wěn)態(tài)、能量生成、轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)節(jié)和信號(hào)傳導(dǎo)。各種形式的FAs被進(jìn)一步認(rèn)為是營(yíng)養(yǎng)狀況、心臟代謝和神經(jīng)退行性疾病以及癌癥的指標(biāo)。例如,一組由八種脂肪酸組成的生物標(biāo)志物可以有效地指示細(xì)胞活力,并表征胺碘酮的肝毒性。FAs的生物學(xué)功能不斷出現(xiàn),但遠(yuǎn)未完全了解,因此在少量樣品中定量脂肪酸組成的高通量方法仍然是必不可少的,特別是對(duì)于大型隊(duì)列研究。
FAs的定量通常使用GC-FID/MS,具有高靈敏度、分離位置異構(gòu)體和順?lè)串悩?gòu)體的能力、出色的穩(wěn)定性以及脂肪酸甲酯(FAMEs)數(shù)據(jù)庫(kù)的可用性。通過(guò)測(cè)量由堿或酸催化的酯交換反應(yīng)產(chǎn)生的脂肪酸甲酯來(lái)實(shí)現(xiàn)。前者包括氫氧化鉀(KOH-MeOH)和甲醇鈉(NaOCH3),后者包括三氟化硼(BF3-MeOH)、甲醇鹽酸(HCl-MeOH)、甲醇硫酸(H2SO4-MeOH)和甲醇乙酰氯(CH3COCl-MeOH)。然而,堿基對(duì)FFAs和SMs的甲基化無(wú)效,而B(niǎo)F3-MeOH不穩(wěn)定且有毒,HCl-MeOH和H2SO4-MeOH制備不方便,高溫下可形成副產(chǎn)物,CH3COCl-MeOH是最合適的方法。
復(fù)旦大學(xué)人類表型組研究院分子表型代謝組平臺(tái)唐惠儒教授團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種使用CH3COCl-MeOH的酯交換方法并確保所有重要形式的脂質(zhì)中的FAs完全甲基化,然后開(kāi)發(fā)了一種快速GC-FID/MS方法,通過(guò)8分鐘的數(shù)據(jù)采集同時(shí)定量多種生物基質(zhì)中的所有FAs。進(jìn)一步建立了FAMEs的無(wú)加性保留指數(shù)(NARI)來(lái)糾正批次效應(yīng),并建立了分析物的定量結(jié)構(gòu)-保留關(guān)系(QSRR)模型來(lái)預(yù)測(cè)沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)的FAMEs的保留率。原文鏈接:https://doi.org/10.52601/bpr.2023.230042。我公司參與了該研究中脂肪酸檢測(cè)方法的部分開(kāi)發(fā)工作。
研究?jī)?nèi)容
采用Agilent 9000氣相色譜(GC)系統(tǒng),火焰電離檢測(cè)器(FID)和Agilent 5977B電子電離質(zhì)譜儀(Agilent Technologies, USA)進(jìn)行定量。采用人血漿樣品,系統(tǒng)優(yōu)化了CH3COCl濃度、反應(yīng)時(shí)間和溫度等參數(shù)。對(duì)方法的靈敏度、線性、精密度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證。利用45個(gè)FA標(biāo)準(zhǔn)的FAMES的實(shí)驗(yàn)tR值,針對(duì)其碳鏈長(zhǎng)度(CL)、雙鍵數(shù)(DB)和DB位置(DBP)等結(jié)構(gòu)特征,構(gòu)建多變量正交多項(xiàng)式回歸模型(MOMR)。采用r -軟件的LM函數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià),并進(jìn)行5次交叉驗(yàn)證,得到預(yù)測(cè)誤差最小的模型。在無(wú)任何外源性添加劑的情況下,選用內(nèi)源FAs中FAMES的實(shí)驗(yàn)tR值建立保留指數(shù),以校正不同實(shí)驗(yàn)條件(如溫度梯度、流速和批間變化)導(dǎo)致的tR變化。
研究結(jié)果
1.脂肪酸的高效酯交換及GC-FID/MS定量分析
將所有脂質(zhì)中的FAs有效轉(zhuǎn)化為FAMEs是使用GC-FID/MS對(duì)其進(jìn)行高覆蓋率定量的先決條件。MeOH-CH3COCl是一種溫和、安全的酯交換試劑。優(yōu)化到最佳反應(yīng)參數(shù):乙酰氯濃度為CH3COCl 12.5%, 衍生化反應(yīng)條件為73°C, 時(shí)長(zhǎng)3 h和甲醇/己烷比(V/V)為6:1,可使95%的脂質(zhì)甲基化(圖1A),不同碳鏈長(zhǎng)度的單鍵和雙鍵不飽和脂肪酸的異構(gòu)化副產(chǎn)物均小于2%(圖1B)。
圖1 A不同脂類的轉(zhuǎn)甲基化效率(12.5% CH3COCl, 73℃,3 h)。包括膽固醇酯(CE)、甘油三酯(TG)、二甘油三酯(DG)、溶血磷脂酰膽堿(LPC)、磷脂酰膽堿(PC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、游離脂肪酸(FFA)、羥基脂肪酸脂肪酸酯(FAHFA)、;鈮A(ACar)、鞘磷脂(SM)和神經(jīng)酰胺(Cer)。B一些代表性不飽和脂肪酸的異構(gòu)化與溫度和CH3COCl濃度的關(guān)系。C 10 μL人體體液(尿液和血漿)和10 mg其他生物基質(zhì)(H1299細(xì)胞、小鼠盲腸內(nèi)容物和兔肝組織)中脂肪酸的濃度。
全面優(yōu)化的GC-FID/MS參數(shù)在8分鐘內(nèi)完成了FAs的同時(shí)定量,顯示了異構(gòu)體的良好分離,如C18:3n6-C18:3n3和C18:2n6t-C18:2n6c(圖2)。此外,該方法具有良好的線性(R2>0.994),柱上的檢出限(信噪比~3)和LOQ(信噪比~10)分別低于20和40 fmol(低至0.5和2 fmol)。對(duì)于三種濃度水平,日內(nèi)和日間CV值均低于20%(95%的分析物低于15%),回收率為80%-120%,在自動(dòng)進(jìn)樣器(20°C)中以及儲(chǔ)存溫度為4°C和-80°C條件下穩(wěn)定性良好(CV<15%)。
圖2 45個(gè)甲基化FAs的GC-FID/MS分析的總離子色譜圖
2.適用多種典型生物基質(zhì)中脂肪酸定量分析
這種方法適用于多種典型生物基質(zhì)(包括人類尿液、血漿、細(xì)胞、動(dòng)物腸道內(nèi)容物和肝組織樣品)中脂肪酸的定量分析。結(jié)果顯示這些生物樣品的FA組成和分子表型存在顯著差異(圖1C),人血漿中FAs的組成與報(bào)道大致一致,成功地定量了健康人血漿中的30種FAs,包括一些低水平的FAs。
3.FAMEs的定量結(jié)構(gòu)-保留關(guān)系和無(wú)添加劑保留指數(shù)
分析物的定量結(jié)構(gòu)-保留關(guān)系(QSRR)對(duì)于預(yù)測(cè)其保留時(shí)間至關(guān)重要。實(shí)驗(yàn)tR結(jié)果清楚地顯示了FAMEs的碳鏈長(zhǎng)度(CL)、雙鍵數(shù)(DB)和位置(DBP)的依賴性。利用MOMR和最佳子集選擇方法,利用45個(gè)代表性FAMEs的數(shù)據(jù)建立了tR作為CL(c), DB(d)和DBP(p)函數(shù)的經(jīng)驗(yàn)數(shù)學(xué)模型,tR=- 6.11E−4c3+2.56E−3c2p+4.58E−2c2+8.21E−3cd2-0.18d2-0.10cp- 0.78c+0.22d+0.97p+5.85。五重交叉驗(yàn)證表明,模型信度相關(guān)性好(R2, 0.9871),殘差標(biāo)準(zhǔn)誤差較小(0.16 min)。這45個(gè)FAMEs的模型計(jì)算值(tRC)與實(shí)驗(yàn)保留時(shí)間(tRE)具有良好的相關(guān)性(R2 ~0.9899) (圖3A)。對(duì)于未納入模型構(gòu)建但在生物樣品中檢測(cè)到的5種測(cè)試分析物,其預(yù)測(cè)tR值與實(shí)測(cè)值一致,ΔtR< 0.38 min(圖3B)。
圖3 (A)定量結(jié)構(gòu)-保留關(guān)系得出的實(shí)驗(yàn)值(tRE)和(B)計(jì)算值(tRC)的相關(guān)性和六種測(cè)試分析物的預(yù)測(cè)精度
此外,為了糾正由于不同溫度梯度、流速和采集批次而導(dǎo)致的tR漂移,開(kāi)發(fā)一種無(wú)添加劑保留指數(shù)(NARI),使用樣品中內(nèi)源性的飽和脂肪酸甲酯(SFAMEs)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的RI中添加的烷烴。在本研究中,在同一批分析的多種不同基質(zhì)(混合FAME標(biāo)準(zhǔn)品、人尿、血漿、H1299C細(xì)胞、小鼠糞便和兔肝組織)中,所有分析物的保留時(shí)間都有微小的變化(ΔtR < 0.04 min)。相比之下,不同溫度梯度、流速和批次之間的保留時(shí)間差異要大得多,從三組SFAMEs得到三種不同的NARI方案都顯示出對(duì)不同溫度梯度、流量和批次的tR變化的修正能力。
研究結(jié)論
開(kāi)發(fā)的一種8分鐘的GC-FID/MS方法,可同時(shí)定量生物樣品中的FA成分,具有飛摩爾級(jí)的靈敏度、良好的準(zhǔn)確度、精密度、穩(wěn)定性以及對(duì)生物流體、細(xì)胞、腸內(nèi)容物和組織的適用性。對(duì)這些生物樣品的分子表型進(jìn)行了定量表征,顯示哺乳動(dòng)物細(xì)胞、肝臟和血漿樣品中多種奇碳脂肪酸的水平異常高,與飲食和腸道微生物有關(guān)。建立了內(nèi)源性分析物的無(wú)添加劑保留指數(shù),以便比較不同批次的tR數(shù)據(jù),進(jìn)一步建立了具有可變鏈長(zhǎng)、雙鍵數(shù)和位置的FAMEs的定量結(jié)構(gòu)-保留關(guān)系,可預(yù)測(cè)沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品情況下FAMEs的tR值。
不同種類樣品中測(cè)到的FA數(shù)量